|
|
Extracelulární váčky a střední T antigen myšího polyomaviru
Kropáček, Václav ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Brázdová, Andrea (oponent)
Tato práce se soustřeďuje na střední tumorový antigen (MT Ag) myšího polyomaviru (MPyV), potenciální důsledky jeho sekrece extracelulárními váčky (EVs) a jeho vliv na buněčnou signalizaci. MT Ag je membránově asociovaný protein schopný navodit nádorovou transformaci díky interferenci s buněčnou signální transdukcí, zejména aberantní aktivací MAP kinázové dráhy. V první části práce jsme proto navázali na předchozí pozorování provedená v rámci naší skupiny, ukazující, že střední T antigen může být sekretovaný z buněk extracelulárními váčky. Zajímalo nás, zda MT Ag může přispívat k transformaci recipientních buněk. Provedli jsme 2 typy izolace extracelulárních váčků z linií myších fibroblastů stabilně exprimujících střední T antigen (3T6MT) a prokázali jsme jeho přítomnost. Provedli jsme charakterizaci izolovaných EVs detekcí exosomálních markerů a kryo-elektronovou mikroskopií. Následně jsme vystavili recipientní buňky myších fibroblastů (3T6) izolovaným EVs a za pomoci průtokové cytometrie zjišťovali, zda došlo k internalizaci MT Ag. Zároveň jsme se pokusili detekovat, zda došlo u buněk vystavených EVs ke zvýšení hladiny fosforylace MAP kinázy Erk. Ve druhé části práce jsme se pokusili potvrdit a podrobněji analyzovat předešlé nepublikované pozorování zvýšené hladiny fosforylace jaderného faktoru...
|
|
|
Polyomavirové minichromozomy: interakce se složkami vrozené imunity
Satratzemis, Christos ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Trejbalová, Kateřina (oponent)
Genom polyomavirů má podobu kruhové dsDNA (double-stranded DNA), která je ve virionech a během celého replikačního cyklu v komplexu s buněčnými histony. Komplex polyomavirové DNA s histony je tak vzhledem ke strukturní podobnosti s chromatinem eukaryot označován jako minichromozom. Stav chromatinu minichromozomu ovlivňuje transkripci a replikaci virové DNA, což by mohlo být využito vrozenou imunitní odpovědí buňky na virovou infekci. Složkou vrozené imunity, jež působí na virový chromatin, je nekanonický histon H3.3, jeho chaperon DAXX-ATRX (death domain associated protein 6-alpha-thalassemia, mental retardation X-linked syndrome) a proteinové komplexy zvané PML (promyelocytic leukemia protein). Pro indukci vrozené imunitní reakce je však nutná detekce molekul signalizujících infekci či buněčný stres. Během infekce myším polyomavirem (MPyV) je reakce spouštěna DNA senzorem cGAS (cyclic GMP-AMP synthase). V této diplomové práci byla sledována distribuce histonu H3.3, chaperonového komplexu DAXX- ATRX a proteinu PML v průběhu infekce MPyV. Histon byl posléze ve virovém chromatinu detekován hmotnostní spektrometrií. Data naznačují, že chaperonový komplex a protein PML by se mohly podílet na regulaci vkládání H3.3 do chromatinu MPyV. Pro další studium senzoru cGAS byl konstruován plazmid kódující...
|
|
|
Buněčné faktory potlačující v hostitelských buňkách infekci myším polyomavirem: Studie PML proteinových izoforem
Anderová, Karolína ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Promyelocytární leukemická jaderná tělíska (PML NBs) jsou multifunkční jaderné sférické struktury tvořené schránkou PML proteinů a dalšími interakčními partnery, které byly popsány v mnoha buněčných procesech i imunitní obraně. Při antivirové imunitní odpovědi působí PML NBs a jejich komponenty jako přímé restrikční faktory i v rámci regulace interferonové odpovědi. Viry zároveň vyvinuly antagonistické mechanismy, jak se této inhibici bránit. Tato práce se zabývá rolí PML NBs při infekci modelovým myším polyomavirem (MPyV) a zaměřuje se na studium izoforem PML proteinu. Prvním cílem práce byla analýza tvorby lidských (hPML) i myších (mPML) NBs v modelu myších embryonálních fibroblastů (MEF). Následně byla zjišťována lokalizace hPML i mPML NBs při infekci. Pro oba druhy byla pozorována lokalizace v těsné blízkosti center replikace virových genomů. V dalším kroku byl testován vliv infekce nebo interferonu α (IFNα) na expresi mPML proteinů. Infekce i ošetření IFNα vedlo k nárůstu exprese mPML na úrovni genové transkripce i syntézy proteinů. Data současně naznačovala největší zvýšení transkripce pro izoformu mPML3. Práce se dále zabývala potenciální restrikční rolí izoformy mPML2. Výsledná data nicméně nenaznačovala, že by nadprodukce mPML2 proteinu infekci signifikantně ovlivňovala. V poslední části...
|
|
|
Studium vlastností virových kapsidových proteinů a vývoj rekombinantních vakcín a diagnostických komponent založených na umělých virových strukturách
Fraiberk, Martin ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Hubálek Kalbáčová, Marie (oponent) ; Hejnar, Jiří (oponent)
Cílem této studie bylo vytvořit systém pro snadnou produkci různých veterinárních chimérických vakcín založených na stabilních strukturách myšího polyomaviru (MPyV). Systém je určen pro antigeny, které jsou problematické z hlediska produkce nebo stability. Nejprve byly navrženy univerzální vektory pro bakulovirovou produkci chimérických, viru podobných částic (VLPs) nebo pentamer založených na hlavním kapsidovém proteinu VP1 MPyV, k jejich využití jako vakcíny proti jiným patogenům. Různé strategie použité v této studii jsou založené na: A) vystavení vybraných imunogenních epitopů na povrchu VLPs MPyV jejich inzercí do povrchové smyčky proteinu VP1, B) inzerci cizorodých peptidů a proteinů dovnitř VLPs nebo C) fúzi cizorodého proteinu nebo jeho částí s C-koncem proteinu VP1, a tedy vytvoření pentamer chimérického proteinu. Kandidátní vakcinační antigeny proti prasečímu cirkoviru typu 2 (PCV2), původci systémových chorob spojených s PCV2 (PCV2-SD), který způsobuje významné ekonomické ztráty v chovech prasat, byly připraveny pomocí zkonstruovaných vektorů. Všechny kandidátní vakcíny byly po imunizaci myší schopny indukovat produkci protilátek proti kapsidovému proteinu PCV2. Kandidátní vakcína VarC založená na fúzním kapsidovém proteinu MPyV a PCV2 dokázala indukovat produkci protilátek s nejvyšší...
|
|
|
Příprava a charakterizace modifikovaných virových částic odvozených od myšího polyomaviru pro přepravu genů za účelem zvýšení účinnosti transdukce
Škvára, Petr ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Virové částice odvozené od myšího polyomaviru mohou být potenciálně využity pro dopravu terapeutických genů či léčiv do cílových buněk. Tato práce se zabývá přípravou a charakterizací polyomavirových částic modifikovaných pomocí peptidů, které penetrují membrány s cílem vytipovat vhodné přístupy pro zvýšení efektivity transdukce reportérového genu do lidských buněk. V práci je analyzován transdukční potenciál virových částic tvořených hlavním kapsidovým proteinem VP1 v kombinaci s minoritním kapsidovým proteinem VP2 a s modifikovaným minoritním strukturním proteinem VP3, který je fúzován s oktaargininem, peptidem LAH4 nebo transdukční doménou adenovirového proteinu VI. Tato práce současně sleduje vliv modifikace na schopnost částic enkapsidovat heterologní DNA. Na základě testování účinnosti transdukce reportérového genu pro luciferázu pomocí modifikovaných částic se ukázalo, že žádná varianta připravených částic významně nezvýšila, ale naopak snížila efektivitu transdukce reportérového genu ve srovnání s nemodifikovanými částicemi. Práce tak přispívá svými poznatky k pochopení role minoritních kapsidových proteinů polyomaviru při přenosu genů a k návrhu nových strategií pro modifikaci částic odvozených od myšího polyomaviru pro jejich využití v nanomedicíně. Klíčová slova: myší polyomavirus,...
|
|
|
Studium pohybu polyomavirů z pozdního endozómu směrem k buněčnému jádru
Štach, Martin ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je modelovým virem čeledi Polyomaviridae. Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry. U imunosuprimovaných pacientů způsobují vážné problémy. Je znám jejich onkogenní potenciál u zvířat i u lidí. Transport MPyV v buňce stále není úplně objasněn. Virus vstupuje hladkými monopinocytickými váčky, pokračuje do časných a pozdních endozomů. Odtud je transportován do ER zatím neznámým mechanismem. Vyhýbá se Golgiho aparátu (GA). Možná cesta z pozdních endozomů je zprostředkovává GTPázou Rab9 do trans-Golgi síťoviny (TGN) a poté COPI váčky do ER. Výzkum, zdali MPyV využívá tuto dráhu na cestě do ER, v minulosti ukazoval různé výsledky. V této práci byl zkoumán účinek inhibitorů retrográdního transportu (Brefeldinu A, Golgicidu A) na infekci MPyV. Brefeldin A není zcela specifický, má vliv na celý endozomální systém. Golgicid A specificky rozrušuje transport přes TGN a GA. Oba inhibitory infekci MPyV inhibovaly. Konfokální mikroskopií bylo zjištěno, že část populace virionů kolokalizuje během jejich transportu k jádru s markery TGN a COPI váčků. MPyV nekolokalizoval s markerem cis-Golgi. Bohužel nebyl zjištěn vliv exprese dominantně negativní mutanty Rab9 na MPyV infekci, pro její vysokou cytotoxicitu. Avšak nadprodukce divokého typu Rab9 infekci usnadňovala. Výsledky podporují...
|
|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Minoritní strukturní proteiny polyomavirů: Vlastnosti a interakce s buněčnými strukturami
Vinšová, Barbora ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
I když jsou polyomaviry intenzivně zkoumány více než 60 let, stále není dostatečně objasněna role minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 v některých důležitých krocích životního cyklu viru, a to zejména jejich úloha při dopravení virového genomu do jádra a také jejich zapojení v pozdní fázi životního cyklu viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium minoritních proteinů Myšího polyomaviru (MPyV) a lidského polyomaviru BK (BKV). V rámci této práce byly připraveny čtyři králičí polyklonální protilátky proti minoritním proteinům virů MPyV nebo BKV. Dvě připravené protilátky jsou namířeny proti minoritním proteinům MPyV (α-MPyV VP2/3) nebo BKV viru (α-BKV VP2/3) a další dvě připravené protilátky rozeznávají společnou C-koncovou sekvenci minoritních proteinů VP2 a VP3 MPyV (α-MPyV C-termVP2/3) nebo BKV viru (α-BKV C-termVP2/3). V druhé části práce jsme se zaměřili na studium toxicity minoritních proteinů polyomaviru BKV při jejich samostatné produkci v savčích buňkách. Získaná data naznačují, že v porovnání s minoritními proteiny VP2 a VP3 viru MPyV, nevykazují minoritní proteiny BKV viru tak vysokou míru cytotoxicity. Třetí část práce je věnována studiu interakcí minoritních proteinů polyomavirů BKV a MPyV s buněčnými proteiny a mezi sebou navzájem. Pomocí připravených protilátek byly...
|
|
|
Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru
Vít, Ondřej ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený virus. Jeho kapsida se skládá ze 72 pentamerů hlavního kapsidového proteinu VP1. Vnitřní prohlubeň každého pentameru VP1 obsahuje jeden minoritní kapsidový protein, buď VP2 nebo VP3. Minoritní proteiny nejsou potřeba ke vzniku kapsidy, avšak pro infekci hostitelské buňky jsou nezbytné, pravděpodobně kvůli jejich předpokládaným funkcím během vstupu viru do buňky. Po vstupu do buňky jsou viriony MPyV dopraveny do endoplazmatického retikula (ER). Předpokládá se, že VP2 a VP3 jsou zodpovědné za narušení membrány ER, které je potřeba pro následné doručení virové DNA do jádra. V sekvenci VP2 a VP3 byly předpovězeny tři hydrofobní domény. První, v unikátní Nkoncové oblasti VP2, druhá a třetí ve společné části sekvence VP2 a VP3. Třetí doména je zároveň C-koncovým alfa-helixem, zodpovědným za vazbu VP1. V naší laboratoři bylo již dříve zjištěno, že VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP mají při produkci v savčích buňkách obdobné VP2 a VP3 divokého typu, konkrétně afinitu k vnitrobuněčným membránám a vysokou cytotoxicitu. Aby bylo zjištěno, která z předpokládaných hydrofobních domén VP2 a VP3 je zodpovědná za afinitu k membránám a cytotoxicitu, byly připraveny expresní plazmidy, nesoucí mutované VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP. Výsledky ukazují, že delece druhé hydrofobní...
|
|
|
Interakce polyomavirových struktur v endoplasmatickém retikulu a na cestě do jádra
Svobodová, Terezie ; Huerfano Meneses, Sandra (vedoucí práce) ; Weber, Jan (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je modelový virus čeledi Polyomaviridae. Aby mohlo dojít k infekci buňky a replikaci viru, musí být virový genom transportován do buněčného jádra. Řada studií nasvědčuje tomu, že viriony jsou transportovány do endoplasmatického retikula, odkud jsou za účasti hostitelských proteinů přeneseny do cytosolu. Mezi takové proteiny patří chaperon BiP (protein vázající imunoglobulin) a kochaperon DNAJ B14. Polyomaviry do jádra pravděpodobně vstupují jaderným pórem za účasti importinů. Tyto procesy byly zatím studovány hlavně při infekci polyomavirem SV40. V této práci ukazujeme, že infekce MPyV vede ke změně lokalizace proteinu DNAJ B14, který se shlukuje do "foci" ve kterých kolokalizuje s virovým kapsidovým proteinem VP1. Výskyt "foci" se během infekce mění. Metodou "proximity ligation assay" jsme ukázali, že DNAJ B14 a BiP se během časné infekce dostávají do bezprostřední blízkosti VP1. Bylo postulováno, že pro cílení virionů k proteinům asociovaným s ERAD a s translokonem jsou důležité záporně nabité aminkyseliny na N-konci minoritního virového proteinu VP2. Vytvořili jsme mutanty MPyV mutované v těchto aminokyselinách. Záporně nabitá aminokyselina v pozici 17 není nezbytná pro úspěšnou infektivitu MPyV. Roli kyselých aminokyselin v pozici 10 a 13 bude nutné dále ověřit. Kromě...
|
host ::
RSS.